2種常見蛋白定量方法——蛋白定量BCA法 VS Bradford法

 

精確的蛋白質定量是蛋白質相關實驗所必需的,這些實驗涉及分子生物學,細胞生物學,生物化學,發育生物學和神經科學的研究課題。依托不同的科學原理,目前已經發展出多種不同的蛋白測定方法,科研工作者廣泛使用的方法比如紫外吸收法(UV),雙縮脲法,考馬斯亮藍法(Bradford)、Folin-酚試劑法(Lowry)、BCA(Bicinchoninic Acid)法、凱氏定氮法等等,各有千秋。今天小編就BCA法,Bradford法,2種常見蛋白定量方法的原理、優缺點以及BCA法實驗操作步驟給大家做詳細介紹,看看哪一種方法能獲得你的支持?

 

BCA(Bicinchoninic Acid)法

 

1、原理:

BCA (bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑,混合一起即成為蘋果綠,即BCA工作試劑。在堿性條件下,BCA與蛋白質結合時,蛋白質將Cu2+還原為Cu+,一個Cu+螯合二個BCA分子,工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復合物,562nm處有最高的吸收值,可在540-595nm測定其吸收值,顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,與標準曲線對比,即可計算待測蛋白的濃度。

 

2、特點:

  • BCA蛋白質測定方法靈敏度高,操作簡單,正常情況下可在45分鐘內完成測定;且試劑及其形成的顏色復合物穩定性俱佳。不方便的是這種方法需要提前制作標準曲線。
  • 靈敏度:例如Abbkine的定量總蛋白的蛋白質定量試劑盒(BCA法),線性標準曲線范圍為50-1000 ug/ml,靈敏度25ug/ ml,最低檢測蛋白量達到5ug。
  • 優點:BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質濃度檢測,可兼容高達5%的SDS,TritonX-100及Tween等。
  • 缺點:由于BCA方法依靠銅離子進行顯色反應,如果溶液中含有與銅離子反應的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT、TCEP和β-巰基乙醇等,結果將受到很大程度的影響。此外,BCA方法的檢測結果也會受到蛋白質內半胱氨酸,酪氨酸,色氨酸含量的影響。

 

3、實驗所需儀器及試劑:

恒溫水浴鍋、可見光分光光度計、離心機、旋渦混合器、試管

 

4、實驗操作:

  • 標準液制備:梯度稀釋牛血清白蛋白(BSA)標準品。將8個EP管按照1到8進行標記,將BSA標準品稀釋成1mg/mL工作液,準備濃度梯0,50,100,200,400,600,800,1000 ug/mL。
  • BCA工作液制備:將A液和B液搖晃混勻,按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液,充分混勻。(BCA工作液室溫下24h內穩定,故現用現配)
  • 加樣孵育:吸取20μL各個稀釋濃度的蛋白質標準品或待測蛋白質樣品,加入96孔板底部或試管中,向孔/管中再加入200uL BCA工作液輕輕搖晃混勻。在37°C下孵育30min,冷卻至室溫。
  • 測定:冷卻到室溫后,以空白為對照,測量樣品在562nm或該波長附近的吸光值
  • 將各個標準品和待測蛋白質樣品在562nm處的吸光值減去空白標準品在562nm處的平均吸光值。

 

5、濃度計算:

  • 在excel表中輸入對應的標準曲線值和蛋白樣品值。(圖中所示均為舉例說明,具體數據請參照個人實際實驗結果),選定標準曲線的OD值和標準品蛋白濃度。

 

BCA蛋白定量BCA法濃度計算

 

  • ?點擊excel表欄:插入-圖表-XY散點圖,并點擊確定。

 

BCA蛋白定量BCA法濃度計算

 

  • 點擊確定后會自動生成XY散點圖,隨意點擊散點圖中的任一的散點,右鍵添加趨勢曲線。

 

BCA蛋白定量BCA法濃度計算

 

  • 點擊趨勢線的拓展欄,選擇“更多選項”

 

BCA蛋白定量BCA法濃度計算

 

  • ?選擇“更多選項”,彈出“設置趨勢圖格式”的畫面,點擊“顯示公式(E)”以及“顯示R平方值”。一般R2值越接近1,表現標準曲線做得越好,根據標準曲線帶入的樣品OD值測出的蛋白濃度也越準確,一般要求為0.99幾左右。

 

BCA蛋白定量BCA法濃度計算

 

  • 將樣品OD值代入標準曲線的公式中,計算即得到待測樣品蛋白的濃度。

 

考馬斯亮藍法(Bradford)

 

1原理:

Bradford法也稱作考馬斯亮藍法,是由Bradford于1976年建立的。該方法的原理是,帶負電的考馬斯亮藍染料與蛋白質中堿性氨基酸相互作用。考馬斯亮藍G250(Coomassie brilliant blue G250),是一種甲基取代的三苯基甲烷,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm變為595nm,溶液的顏色也由游離狀態下的棕紅色變為藍色。并且在一定濃度范圍內,穩定的染料-蛋白復合物的OD值與蛋白質含量呈線性關系。通過分光光度計或者酶標儀以標準品蛋白做標準曲線,隨后檢測目標蛋白595nm波長處的吸光值,即可換算出目標蛋白濃度。

 

2、特點:

  • 簡單便捷:僅需一種反應試劑即可完成檢測,操作十分便捷,完成一個樣品的測定只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時內保持穩定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩定性最好,不用考慮時間的限制。
  • 靈敏度:例如Abbkine的蛋白質定量試劑盒(Bradford法,線性標準曲線范圍為50-1000 ug/ml,靈敏度25ug/ ml,最低檢測蛋白量達到5ug。反應非常靈敏,靈敏度比Lowry法還高4倍,可測定微克級蛋白質含量。
  • 優點:?Bradford 法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響,如:K+ 、Na+ 、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巰基乙醇等。
  • 缺點:由于蛋白-染料穩定復合物之間是分子間作用力,故Bradford法會受到表面活性劑如:去污劑、1N的NaOH 、SDS、Triton X-100,Tween 20等的干擾。除此之外,不同靶標蛋白中堿性氨基酸(范德華力作用)以及芳香族氨基酸(疏水作用)含量不一,對考馬斯亮藍的結合能力差異較大;而且隨著蛋白濃度增加,線性關系會出現偏差。

注意:

  • 由于高濃度洗滌劑會影響檢測結果的可靠性,必須確保樣品中的SDS的濃度低于1%,Triton X-100低于0.1%,Tween 20,60,80低于0.06%。
  • 檢測蛋白濃度的考馬斯亮藍和染色PAGE膠的考馬斯亮藍不是同一種物質,前者采用考馬斯亮藍G250,后者采用考馬斯亮藍R250,G250和R250分子基本骨架一樣,但是G250多了兩個甲基,與蛋白反應迅速,染膠慢且脫色困難,故用于蛋白定量;R250與蛋白反應較緩慢,染膠較快且易于洗脫,故用于PAGE膠染色。

 

通過以上兩種蛋白定量的方法的對比,我們可以發現對于BCA法和Bradford法,每一種方法都有自身的優勢和缺陷,因此針對同一樣本采用不同的方法進行檢測,檢測結果也可能出現偏差。所以我們在使用時,應當根據實驗條件挑選最合適的檢測方法,這樣實驗數據才會更可靠!

 

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名稱 貨號 規格
蛋白質定量試劑盒(BCA法) KTD3001 500T/2000T/5000T
蛋白質定量試劑盒(Bradford法) KTD3002 500T/2000T/5000T

 

Abbkine專注于蛋白學和細胞學領域,致力于創新和研發各類抗體、蛋白質、分析試劑與試劑盒,以期成為生命科學研究發展、藥物研發等領域的關鍵推動者。我們為您提供蛋白和免疫研究用戶最喜愛的產品,從免疫學基礎產品,如蛋白提取定量,到免疫學實驗的內參標簽抗體、一抗及二抗等;細胞研究用戶最喜愛的產品,從用于檢測細胞狀態的染料及試劑盒,細胞器提取試劑盒,細胞亞結構染色示蹤及細胞代謝檢測產品,到用于細胞培養的細胞因子及蛋白類檢測試劑盒,只為助力您的研究事業!

 

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