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在病毒診斷中,核酸擴增測試,例如逆轉錄PCR反應 (RT-PCR),可以及早發現和識別逆轉錄病毒導致的傳染病。在這個標準 PCR 過程中,作為初始模板的 mRNA 首先被逆轉錄為互補 DNA (cDNA),然后通過 PCR 擴增以進行下游分析。相對于其他測量 mRNA 的技術,例如 Northern Blot、RNAse 保護分析或熒光原位雜交,RT-PCR 在檢測任何基因的 RNA 轉錄物時明顯更加有優勢。RT-PCR 已成為檢測病原體的常規方法,包括流感病毒、腸道病毒、冠狀病毒 (SARS-CoV-2)、埃博拉病毒和 HIV等。

 

RT-PCR 已成為檢測病原體的常規方法

 

1.?逆轉錄病毒

逆轉錄病毒是一種遺傳物質為RNA的病毒,與其他病毒類似,逆轉錄病毒通過劫持細胞中的細胞器進行自身的復制。病毒感染細胞后,逆轉錄病毒利用其自身的逆轉錄酶從其 RNA 基因組中合成雙鏈 DNA。新合成的病毒 DNA 被整合到宿主細胞基因組中,然后病毒的遺傳物質作為宿主細胞 DNA 的一部分一起進行復制。

在人類歷史上,出現過許多導致嚴重的疾病的逆轉錄病毒:HIV-1 和 HIV-2 等逆轉錄病毒會導致艾滋病,而人類 T 淋巴細胞病毒會導致白血病(即血癌)和脫髓鞘病。這些嚴重的疾病和新出現的傳染病的持續威脅,再次證實了開發能夠檢測低密度感染的快速診斷工具是多么的有必要的,用于早期檢測逆轉錄病毒感染的最完善的工具之一是核酸擴增檢測。

 

2.?核酸擴增試驗

核酸擴增檢測旨在檢測少量特定核酸序列,以識別特定病原體,通常是病毒或細菌。核酸擴增測試不是檢測抗原或抗體(血清學分析的目標),而是針對并檢測遺傳物質,例如 DNA 或 RNA。遺傳物質的檢測允許在血清轉化之前對感染進行早期診斷,在此期間,特異性抗體針對病原體產生并在血液中可檢測到。常見的核酸擴增檢測包括RT-PCR、鏈置換試驗 (SDA) 或轉錄介導試驗 (TMA)。

逆轉錄 PCR (RT-PCR)

逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR) 是一種用于檢測和定量 mRNA 表達水平的高度靈敏的技術。在 RT-PCR 中,首先使用逆轉錄酶將 RNA 模板逆轉錄為互補 DNA (cDNA)。這種依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶在逆轉錄引物、脫氧核苷酸(dNTP:dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)的幫助下,催化從其各自的目標 RNA 序列合成 cDNA。然后將 cDNA 用標準 PCR 程序(變性、退火和延伸)進行指數擴增然后再進行檢測。RT-PCR 已被用于多種應用,包括基因表達分析、微陣列驗證、病原體檢測和疾病研究。

RT-PCR產物的定量一般可分為兩類:終點RT-PCR定量RT-PCR(RT-qPCR

表1. 用于 PCR、RT-qPCR 和RT-PCR 的脫氧核苷酸 (dNTP)

產品 溶劑 規格 貨號
ReadiUse™ dNTP Mix *10 mM* 5 ml 17200

 

3.?終點RT-PCR

終點 RT-PCR 是分析基于 PCR 反應的平臺期,用于在 PCR 反應的所有循環完成后分析擴增產物的技術,在該方法中,擴增子通過瓊脂糖凝膠電泳分離,并使用 DNA 結合染料(如溴化乙錠 (EtBr))進行可視化,用來確定 500至30,000 bp 范圍內的 DNA 分子大小。雖然 EtBr 是最常用的 DNA 可視化染料,但它具有致突變性和吸入毒性。因此,可以考慮使用更安全、更環保、無毒的替代品,例如 Gelite™ X100(貨號:17706)、Helixyte™ Green(貨號:17590)、Helixyte™ Gold(貨號:17595)、Gelite™ Green(貨號:17589?) 或 Gelite™ Orange(貨號:17594)。

表 2. 終點RT-PCR的優缺點及應用

終點RT-PCR

優點 l?方便 - 適用于任何雙鏈 DNA 序列的分析
l?經濟 - 比使用定制設計的探針更便宜
缺點 l?精度差,靈敏度低
l?動態范圍窄?< 2 個logs
l?分辨率低,僅基于大小進行區分
l?不適合自動化
l?結果不表示為數字
l?PCR后處理
應用 l?基因表達分析
l?克隆
l?構建 cDNA 文庫
l?RNA測序
l?微陣列探針開發
l?物種鑒定

 

表 3. 用于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳的核酸染

產品 Ex (nm)1 濾光片 規格 貨號
Helixyte™ Green 核酸凝膠染料 498nm 長路徑綠色濾光片 1ml 17590
Helixyte™ Green 核酸凝膠染料 498nm 長路徑綠色濾光片 100ul 17604
Helixyte™ Gold 核酸凝膠染料 496nm 長路徑綠色濾光片 1ml 17595
Gelite™ Green 核酸凝膠染色試劑盒 254nm或 300nm 長路徑綠色濾光片 1kit 17589
Gelite™ Orange 核酸凝膠染色試劑盒 254nm或 300nm 長路徑綠色濾光片 1kit 17594
Gelite™ Safe DNA 凝膠染料 254nm、300nm或 520nm 溴化乙錠、Gel Star、Gel Green、Gel Red 和 SYBR濾光片 100ul 17700
Gelite™ Safe DNA 凝膠染料 254nm、300nm或 520nm 溴化乙錠、Gel Star、Gel Green、Gel Red 和 SYBR濾光片 500ul 17701
Gelite™ Safe DNA 凝膠染料 254nm、300nm或 520nm 溴化乙錠、Gel Star、Gel Green、Gel Red 和 SYBR濾光片 1ml 17702
Gelite™ Safe DNA 凝膠染料 254nm、300nm或 520nm 溴化乙錠、Gel Star、Gel Green、Gel Red 和 SYBR濾光片 10ml 17703
Gelite™ Safe DNA 凝膠染料 254nm、300nm或 520nm 溴化乙錠、Gel Star、Gel Green、Gel Red 和 SYBR濾光片 10ul 17704

 

4.?RT-qPCR

在定量 RT-PCR (RT-qPCR) 中,熒光標記的核苷酸或序列特異性熒光探針被整合到 RT-PCR 反應中,允許在 PCR 的指數階段實時測量目的基因的濃度。實現了將擴增和檢測結合到一個步驟中,RT-qPCR 提供了更高的精確度和準確度。由于擁有更高的靈敏度,RT-qPCR 通常用于分析基因表達中的 mRNA、檢查逆轉錄病毒的存在以及驗證通過陣列分析獲得的結果。

 

墻裂推薦:用于 RT-qPCR 的 Helixyte™ Green染料

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RT-qPCR 使用熒光 DNA 嵌入染料,例如 Helixyte™ Green(貨號17591)?為實時檢測和定量 PCR 擴增子提供了最簡單、最經濟的方法。Helixyte™ Green 可以與雙鏈 DNA (dsDNA) 結合,并在激發時發光。?連續擴增循環使目的基因的濃度增加,Helixyte™ Green 的熒光強度也會增加,其程度與每個 PCR 循環中存在的 dsDNA 量成正比。Helixyte™ Green 是EtBr 更安全的替代品,也擁有更高的靈敏度,可用于檢測任何 dsDNA 序列的擴增。(Note由于 DNA 嵌入染料會與所有的?dsDNA 結合,例如引物二聚體和非特異性產物,因此使用精心設計的引物以避免擴增非特異性序列非常重要。

 

表 4. 用于 qPCR 的雙鏈 DNA 結合染料

產品名稱 Ex(nm) Em (nm) 規格 貨號
Helixyte™ Green *20X PCR 水溶液* 498nm 522nm 5x1ml 17591
Helixyte™ Green *10,000X PCR 水溶液* 498nm 522nm 1ml 17592
Helixyte™ Green dsDNA 定量試劑 *200X DMSO 溶液* 490nm 525nm 1ml 17597
Helixyte™ Green dsDNA 定量試劑 *200X DMSO 溶液* 490nm 525nm 1ml 17598
Q4ever™ Green *2000X DMSO 溶液* 503nm 527nm 50ul 17608
Q4ever™ Green *2000X DMSO 溶液* 503nm 527nm 1ml 17609

 

5.?用于 RT-qPCR 的 TaqMan? 探針和分子信標

在基于探針的 RT-qPCR 中,熒光標記的目的基因特異性探針可用于實時監測?DNA 的擴增。這種方法具有極高的特異性,并可以在單個反應中同時檢測多個目標,在諸多的基于探針的 RT-qPCR 檢測方法中,TaqMan? 探針和分子信標是使用最廣泛的,兩者都依賴于 F?rster 共振能量轉移 (FRET) 來產生熒光信號:TaqMan? 探針依賴于Taq?DNA 聚合酶的 5'-核酸酶活性,與靶標互補的短寡核苷酸序列在 5' 端用熒光報告染料標記(見表 5),在 3' 端用非熒光猝滅染料標記(見表 6),在 PCR 循環期間,引物和探針與靶標退火,當 Taq DNA 聚合酶與探針上游的引物結合并延伸時,雜交的探針被水解,含有報告染料的片段被釋放,然后就可以檢測熒光信號,產生的熒光信號量與產生的 qPCR 產物量成正比。

 

5.用于 RT-qPCR 的 TaqMan? 探針和分子信標

與 TaqMan? 探針一樣,分子信標在 5' 端用熒光報告染料標記,在 3' 端用非熒光淬滅染料標記。然而,該方法不依賴于Taq?DNA 聚合酶的 5' 核酸酶活性來產生信號,而是分子信標在整個擴增過程中都保持完整,在沒有靶標的情況下,分子信標由于其自我互補的莖環結構而依然保持在“發夾”確認狀態,這使熒光報告基因和淬滅染料彼此靠近,防止探針發熒光。當分子信標與其靶標雜交時,熒光報告基團和淬滅基團分離,報告染料在特定波長處發光。

我們提供一系列的染料標記的亞磷酰胺和染料 CPG 支持物,便于開發 FRET 寡核苷酸、TaqMan? 探針和分子信標。染料類型包括各種經典染料,例如 FAM、HEX、TET 和 JOE,以及全新的寡標記染料,例如 Tide Fluor™ 和 Tide Quencher™ 染料。

表 5. 用于標記qPCR 探針的報告熒光染料

產品名稱 Ex(nm) Em (nm) 規格 貨號
EDANS 酸 [5-((2-Aminoethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acid] *CAS 50402-56-7* 336 455 1g 610
EDANS 酸 [5-((2-Aminoethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acid] *CAS 50402-56-7* 336 455 10g 611
EDANS C5馬來酰亞胺 336 455 5mg 619
EDANS 鈉鹽 [5-((2-Aminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid, 鈉鹽] *CAS 100900-07-0* 336 455 1g 615
EDANS 鈉鹽 [5-((2-Aminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid, 鈉鹽] *CAS 100900-07-0* 336 455 10g 616
Tide Fluor™ 1 酸 [TF1 酸] *EDANS 的卓越替代品* 341 448 100mg 2238
Tide Fluor™ 1 炔烴 [TF1 炔烴] 341 448 5mg 2237
Tide Fluor™ 1 胺 [TF1 胺] * EDANS 的卓越替代品* 341 448 5mg 2239
Tide Fluor™ 1 疊氮化物 [TF1 疊氮化物] 341 448 5mg 2236
Tide Fluor™ 1 CPG [TF1 CPG] *500 ?* 341 448 100mg 2240

 

表 6. 用于標記qPCR 探針的淬滅染料

產品名稱 Ex(nm) Em (nm) 規格 貨號
3'-DABCYL CPG *1000 ?* 454 N/A 1g 6008
5(6)-TAMRA [5(6)-羧基四甲基羅丹明] *CAS 98181-63-6* 552 578 100mg 360
5(6)-TAMRA [5(6)-羧基四甲基羅丹明] *CAS 98181-63-6* 552 578 1g 361
5(6)-TAMRA [5(6)-羧基四甲基羅丹明] *CAS 98181-63-6* 552 578 5g 362
5(6)-TAMRA C6馬來酰亞胺 552 578 5mg 423
5(6)-TAMRA尸胺 552 578 25mg 355
5(6)-TAMRA 乙二胺 552 578 25mg 354
5(6)-TAMRA 馬來酰亞胺 [四甲基羅丹明-5-(和-6)-馬來酰亞胺] 552 578 5mg 412
5(6)-TAMRA, SE [5-(和-6)-羧基四甲基羅丹明,琥珀酰亞胺酯] *CAS 246256-50-8* 552 578 25mg 370
5(6)-TAMRA, SE [5-(和-6)-羧基四甲基羅丹明,琥珀酰亞胺酯] *CAS 246256-50-8* 552 578 100mg 371

 

表 7. 用于開發 FRET 寡核苷酸的推薦FRET 熒光

受體
供體
DAB

CYL

Tide
Quencher™ 1
Tide
Quencher™ 2
Tide
Quencher™ 3
Tide
Quencher™ 4
Tide
Quencher™ 5
Tide
Quencher™ 6
Tide

Quen

cher™ 7

Tide
Fluor™4
- - - + +++ + - -
Tide
Fluor™1
+++ +++ + - - - - -
ROXTexas

Red?

- - - + +++ + - -
MCA +++ +++ + - - - - -
HEXJOE

TET

- - + +++ + - - -
FAMFITC + + +++ + - - - -
EDANS +++ +++ + - - - - -
Cy7?

Tide

Fluor™

7

- - - - - - + +++
Cy5?

Tide
Fluor™

5

- - - - + +++ + -
Cy5.5?Tide

Fluor™

6

- - - - - + +++ +

 

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